复旦团队发现预测三阴乳腺癌化疗效果的血液生物标志物

最新全球癌症统计报告数据显示，女性乳腺癌超过肺癌，成为全球第一大癌症，2020年大约新发230万例，占全部新发癌症病例的11.7%[1]。

三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达均阴性的乳腺癌，占侵袭性乳腺癌的10%-20%。和其他亚型相比，TNBC具有侵袭性强，易转移，预后差等特点，因其缺乏靶向受体，治疗方案有限，使其成为临床亟需攻克的难题[2，3]。

已有研究表明，铂类药物在TNBC新辅助化疗和转移性TNBC治疗中显示出良好的疗效[4]。但铂类药物化疗经济成本高，副作用较大，部分患者对铂类化疗不敏感，延误了治疗时机。因此，探索有效的治疗反应预测指标，筛选可能受益的TNBC亚组人群具有重要的临床意义。

近年来，核仁小RNA（snoRNA）受到广泛关注，研究表明，snoRNAs在外周血浆和血清中可稳定存在，易于富集和检测，与肿瘤的临床病理特征和预后密切相关，可作为液体活检的潜在生物标志物[5]。这无疑给研究人员带来了新的研究思路和希望。

近日，复旦大学胡夕春、张思、陈舌和付朝伟等领衔的研究团队发现：血浆核仁小RNA SNORD33是铂类药物疗效预测标志物，他们还揭示了SNORD33调控铂类耐药相关分子机制。相关研究成果在线发表于著名期刊Molecular Cancer上。

▲论文首页截图

接下来我们就一起来看看这个研究是如何开展的。

首先，研究人员构建了顺铂耐药TNBC细胞株MDA-MB-231/DDP，其对顺铂的耐药性是母代细胞株MDA-MB-231的5倍。通过RNA测序发现，共有277个RNA在MDA-MB-231/DDP细胞中异常表达，其中snoRNA的变异率最高（12.3%）。在所有变化的snoRNAs中，SNORD33的变化最大，降低最为显著。

随后，研究人员在MDA-MB-231、MDA-MB-468和SUM149PT细胞中沉默SNORD33的表达后，进行了细胞实验，探究SNORD33对TNBC细胞功能的影响。

结果显示，SNORD33敲除后，乳腺癌细胞的增殖能力增强，凋亡细胞显著减少。他们还在SNORD33敲除细胞中检测到抗凋亡蛋白（Mcl-1和Bcl-2）水平显著增加，促凋亡蛋白（活化caspase-3和caspase-9）表达降低。

以上研究表明，在顺铂耐药的TNBC细胞中SNORD33表达显著降低，下调SNORD33表达增强了TNBC细胞对顺铂的耐药性。

▲SNORD33对TNBC细胞生物功能的影响

231/DDP细胞对顺铂耐药性增加（图a）；热图分析显示，与231细胞相比，231/DDP细胞中，snoRNAs表达存在差异（图b），火山图分析显示，SNORD33的表达降低最为显著（图c）；SNORD33在231/DDP细胞中表达下调（图d）；SNORD33敲除后，TNBC细胞顺铂耐药性增加（图e）

在体外细胞功能实验中，SNORD33对TNBC细胞顺铂耐药性的影响是显而易见的，那么SNORD33在TNBC患者血浆中的表达情况，及其与患者预后之间的关系又是如何呢？

首先，研究人员从三个临床试验中收集了255例mTNBC患者的血浆，其中一线化疗方案不含铂类药物的45例，含铂类药物的209例（训练队列81例，验证队列128例，联合队列209例中有114例随机接受了BRCA 基因突变检测）。

在训练队列中，根据血浆中SNORD33表达水平，将81个样本分为SNORD33高表达组和SNORD33低表达组，这两组之间的基线特征基本持平。分析发现，低SNORD33组的无进展生存期（PFS）明显短于高SNORD33组（6.6个月vs10.1个月）。

在验证队列和组合队列的分析结果与以上结论一致：低SNORD33组的PFS显著降低（验证队列：6.5vs10.1个月；联合队列：6.6vs10.1个月）。

在联合队列中，与高SNORD33组相比，低SNORD33组的总生存期（OS）显著降低（22.2个月对40.6个月）。单因素Cox回归分析显示，SNORD33低表达、转移灶数量、内脏转移和肝转移与PFS和OS降低显著相关。在多因素分析中，SNORD33是铂类化疗PFS的独立预测因素。

同时，在三个研究队列中，达到临床疗效（CB）患者的血浆SNORD33显著高于未达到CB的患者。

此外，接受非铂类化疗患者血浆SNORD33水平的变化与PFS无关。

以上研究结果表明，SNORD33表达水平的预测值具有铂类药物特异性。而目前研究最多的乳腺癌铂敏感性生物标志物BRCA突变状态，与血浆SNORD33水平无关，也与铂类化疗患者的PFS无关。

ROC分析发现，与其他单一临床病理风险因素如肝转移和转移灶的数量相比，SNORD33血浆水平作为铂类化疗结果预测因子，具有更好的临床应用价值（AUC = 0.652）。

最后，研究人员根据多因素Cox回归模型中血浆SNORD33水平、肝转移和转移灶数量，绘制了预测含铂方案PFS时间的列线阵图，用于预测患者铂类药物治疗不同时间临床缓解可能性，预后列线图所提供的这些信息可以为临床医生选择方案时提供重要的参考价值。

▲mTNBC患者血浆中SNORD33的表达水平与相应预后之间的关系

患者的选择和研究设计（图f）；接受含铂方案治疗的mTNBC患者的中位无进展生存期（PFS）的与血浆中SNORD33的表达水平的关系，训练队列（图g），验证队列（图h）；接受非铂方案治疗的mTNBC患者的中位无进展生存期（PFS）的与血浆中SNORD33的表达水平的关系（图i）；在达到临床疗效的患者中，血浆SNORD33水平显著升高（图j）；BRCA突变与血浆SNORD33水平无相关性（图k）也与PFS无关（图l）；与是否有肝转移和转移灶数量相比，血浆SNORD33对PFS的预测价值最高（图m）；TNBC患者在铂治疗开始后发生PFS的概率（图n）；列线图的校准曲线（图o）。

接下来，研究人员进一步探索了SNORD33影响铂类耐药的机制。

首先，研究人员通过RNA拉下试验结合质谱分析，发现SNORD33通过阻止甲基化结合蛋白2（MeCP2）与甲基化CpG DNA的结合，来调节MeCP2靶向基因的表达。SNORD33表达下调可释放MeCP2的转录抑制活性，进而抑制促凋亡基因的表达，肿瘤细胞凋亡减少，增加三阴性乳腺癌细胞对铂类的耐药。

▲在MDA-MB-231细胞中，RPL13A、DICER酶或SNORD32a被敲除（图a）；RPL13A、DICER酶或SNORD32a基因敲除不会改变细胞对铂的耐药性（图b）；银染条带显示实验组和对照组条带（图c）；在MDA-MB-231细胞中进行RNA下拉和RIP（RNA免疫沉淀）分析（图d）；MDA-MB-231细胞中SNORD33基因敲除不会改变MeCP2 mRNA和蛋白质水平（图e）；在敲除SNORD33的MDA-MB-231细胞中，MeCP2靶基因的mRNA水平降低。（图f）；SNORD33基因敲除促进MeCP2与下游靶基因启动子的结合（图g）；SNORD33基因敲除不会改变共抑制因子mSIN3A和HDAC1与MeCP2的结合（图i）。

随后，为了进一步证实以上结论，研究人员在SNORD33敲除的TNBC细胞系中敲除MeCP2后发现，MeCP2下调减弱了SNORD33基因敲除诱导的促凋亡蛋白减少和细胞凋亡，使抗凋亡蛋白表达增加，可部分逆转TNBC细胞因SNORD33缺失而产生的铂耐药。

▲MeCP2下调可部分逆转SNORD33敲除诱导的细胞铂耐药（图j）；流式细胞术测定顺铂处理细胞凋亡情况（图k）；westernblot检测顺铂处理细胞的凋亡相关蛋白的变化（图l）

以上这些数据表明，SNORD33通过影响MeCP2与靶蛋白的结合调控凋亡相关基因的表达，进而影响细胞的凋亡，MeCP2被认为是SNORD33调控TNBC细胞铂类耐药的潜在靶点。

总的来说，在这个研究中，研究人员先是成功构建铂类耐药TNBC细胞株，通过RNA测序检测表达异常的RNA，发现核仁小RNA，SNORD33；并且通过一系列研究，证实SNORD33与TNBC细胞对顺铂的耐药密切相关，随后进一步探索了血浆SNORD33在mTNBC患者中的表达情况及其与患者预后之间的关系，并构建了预测含铂方案PFS时间的列线图。最后，他们还揭示了SNORD33影响铂类耐药的分子机制。整个过程环环相扣，这一研究为TNBC患者临床结局的预测和临床治疗方案的选择提供了高效、简便，可靠的血浆标志物。

我们也期待SNORD33在新辅助化疗及其它肿瘤患者含铂治疗方案中的临床研究，希望看到SNORD33能尽快应用于临床治疗，为肿瘤患者带来更多获益。

参考文献：

1.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi:10.3322/caac.21660

2.Perou CM, Sørlie T, Eisen MB, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752. doi:10.1038/35021093

3.Berrada N, Delaloge S, André F. Treatment of triple-negative metastatic breast cancer: toward individualized targeted treatments or chemosensitization?. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 7:vii30-vii35. doi:10.1093/annonc/mdq279

4.Denkert C, Liedtke C, Tutt A, von Minckwitz G. Molecular alterations in triple-negative breast cancer-the road to new treatment strategies. Lancet. 2017;389(10087):2430-2442. doi:10.1016/S0140-6736(16)32454-0

5.Liao J, Yu L, Mei Y, et al. Small nucleolar RNA signatures as biomarkers for non-small-cell lung cancer. Mol Cancer. 2010;9:198. Published 2010 Jul 27. doi:10.1186/1476-4598-9-198

责任编辑丨BioTalker